Design och karakterisering av molekylära verktyg för ett syntetiskt-biologiskt förhållningssätt för att utveckla cyanobakteriell bioteknik

Vårt projekt

Syntetisk biologi är design och konstruktion av nya biologiska delar, enheter och system, samt omdesign av befintliga biologiska system för användbara ändamål (http://syntheticbiology.org). De grundläggande principerna för syntetisk biologi är: (i) användningen av standardiserade och välkaraktäriserade byggstenar, (ii) den hierarkiska utformningen av naturinspirerade, artificiella genetiska kretsar och proteiner i silico, och (iii) användningen av kemiskt syntetiserat DNA sekvenser som inte finns i naturen. För en rationell utformning av artificiella genetiska kretsar måste beteendet hos varje enskild del av kretsen karakteriseras väl. Promotorer är nyckeldelar för det heterologa uttrycket av proteiner. Visionen för cyanobakteriell syntetisk biologi är att bygga upp ett förråd av genetiska standarddelar som delas av forskarsamhället för att påskynda framgångsrik genetisk/metabolisk ingenjörskonst för hållbar produktion av värdefulla produkter.

Oavsett alla ansträngningar att karakterisera promotorn och förstå dess beteende under olika förhållanden, är det klart att det fortfarande kommer att vara beroende av celltranskriptionsmaskineriet. Därför kan oönskad överhörning mellan olika transkriptionsnätverk vara för svår att isolera, vilket resulterar i oväntade uttrycksmönster och leder till onormalt metaboliskt flöde. Följaktligen krävs ortogonala promotorer för att kontrollera uttrycket av gener när metaboliska vägar ska introduceras eller modifieras. Som ett exempel har hybridpromotorerna tac och trc använts för att reglera uttrycket av olika gener i cyanobakterier. Dessa väl beskrivna promotorer som används i Escherichia coli har emellertid visat sig reagera annorlunda i en cyanobakteriell bakgrund, vilket stöder uppfattningen att alla dessa delar måste initialt och grundligt karakteriseras i cyanobakterier.

Principen bakom Syntetisk Biologi är att på ett standardiserat ingenjörsmässigt sätt designa och konstruera en cell med önskad funktion och metabolism. Det är ett molekylärt tillvägagångssätt som använder standardiserade artificiellt syntetiserade genetiska byggstenar (så kallade BioBricks; t.ex. promotorer, RBS, gener, transkriptionsstopp, nedbrytningstaggar) i en multifunktionell kloningsvektor. Den kemiska DNA-syntesen möjliggör produktion och användning av DNA-sekvenser som inte finns i naturen. De enskilda specifika byggstenarna byts enkelt ut mot andra med hjälp av det standardiserade BioBrick-gränssnittet.

För att möjliggöra utvecklingen av Cyanobacterial Synthetic Biology har vi tidigare utvecklat och karakteriserat bl.a. flera molekylära verktyg: (i) en BioBrick-skyttelvektor med brett spektrum konstruerad och bekräftad att replikera i E. coli och i cyanobakterier, (ii) reportergener, (iii) RBS, (iv) promotorer (konstitutiva och reglerade), och (v) proteinnedbrytningstaggar.

För närvarande vidareutvecklar vi reglerade promotorer med ett brett dynamiskt område som ska användas vid framställning av cyanobakterier för specifika ändamål.

Utvalda referenser

• Camsund, Lindblad (2014) Engineered transcriptional systems for cyanobacterial biotechnology. Front Bioeng Biotechn 2: 40 (doi: 10.3389/fbioe.2014.00040).
• Huang, Lindblad (2013) Wide-dynamic-range promoters engineered for cyanobacteria. J Biol Eng 7:10 (doi:10.1186/1754-1611-7-10).
• Heidorn et al (2011) Synthetic Biology in Cyanobacteria: Engineering and Analyzing Novel Functions. Meth Enzymol 497:540-79 (doi:10.1016/B978-0-12-385075-1.00024-X).
• Huang et al (2010) Design and characterisation of molecular tools for a Synthetic Biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucl Acids Res 38:2577-93 (doi:10.1093/nar/gkq164).