In vitro bioassays för pro- och retrospektiv miljötoxicitetsprövning.

CRISPR/Cas-tekniken

Beskrivning

Projektledare: Sebastian Lungu Mitea

Pro- och retrospektiv toxicitetsprövning av kemikalier svarar för cirka 25% av alla försöksdjur som används i forskningssammanhang. Förutom gnagare, är fisk den näst mest använda djurmodellen när man identifierar olika ämnens potentiellt toxiska effekter för människa. Många nya metoder har tagits fram för att reducera antalet djur i toxtesterna. När det gäller ekotoxikologin har denna utveckling inte varit lika framträdande. De metoder som tagits fram saknar ofta relevans ur ett ekologiskt perspektiv, och de är ofta tekniskt komplicerade. Detta gäller inte minst de som bygger på transgena tekniker då de synes vara behäftade med olika artefakter.

I det aktuella projektet prövas en ny variant som bygger på CRISPR/Cas-tekniken som har en högre upplösning och noggrannhet. Vi använder nu denna teknik i helt ny assay där vi använder olika ”rapportörgener” vid utvärderingen av olika primära toxikologiska verkningsmekanismer som är relevanta utifrån ett miljötoxikologiskt perspektiv. Vi använder då olika cellinjer från zebrafisk som bärare av dessa gener. Uttrycket av rapportörgenerna sker via endogena regulatoriska element som uttrycks på sin normala plats i genomet. På så sätt kan en fysiologisk respons efter exponering för en testsubstans avläsas utan att den naturliga balansen satts ur spel, dvs att det man avläser är en faktisk effekt av testsubstansen och inte en följd av artefakter.

Parallellt med de laborativa experimenten baserade på den nya CRISPR/Cas-tekniken kommer databaserade modelleringar göras, inkluderande bland annat mass-balansekvationer, och för att extrapolera från in vitro- till in vivo-situationer. Modelleringarna används för att beräkna faktisk biotillgänglighet in vivo, så att realistiska koncentrationer används i in vitro-försöken. Förhoppningen är att regulatoriska myndigheter ska acceptera denna approach, så att antalet akuta och kroniska toxtester på levande djur kan minimeras, eller i vart fall reduceras signifikant, vid utvärderingen av kemikaliers miljötoxicitet

Projektet, som beviljats finansiering under 2 år (totalt 2 miljoner kronor) via vetenskapsområdets U-Share projekt, är ett samarbetsprojekt mellan UU, SLU och KI.

  • Lungu-Mitea S, Lundqvist J. Potentials and pitfalls of transient in vitro reporter bioassays: interference by vector geometry and cytotoxicity in recombinant zebrafish cell lines. Arch Toxicol. 2020 Aug;94(8):2769-2784. doi: 10.1007/s00204-020-02783-6. Epub 2020 May 23. PMID: 32447522; PMCID: PMC7395025
  • Lungu-Mitea S, Han Y, Lundqvist J. Development, scrutiny, and modulation of transient reporter gene assays of the xenobiotic metabolism pathway in zebrafish hepatocytes. Cell Biol Toxicol. 2021 Oct 15. doi: 10.1007/s10565-021-09659-0. Epub ahead of print. PMID: 34654992.
  • Lungu-Mitea S, Vogs C, Carlsson G, Montag M, Frieberg K, Oskarsson A, Lundqvist J. Modeling Bioavailable Concentrations in Zebrafish Cell Lines and Embryos Increases the Correlation of Toxicity Potencies across Test Systems. Environ Sci Technol. 2021 Jan 5;55(1):447-457. doi: 10.1021/acs.est.0c04872. Epub 2020 Dec 15. PMID: 33320646; PMCID: PMC7872314.

Senast uppdaterad:

FÖLJ UPPSALA UNIVERSITET PÅ

facebook
instagram
twitter
youtube
linkedin